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新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

??解決血清使用中的常見問題

新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

1、 如何儲存和解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損？

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

長時間儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。因此，推薦在-20℃以下儲存血清，并避免反復(fù)凍融。

我們建議血清應(yīng)保存在-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

2、血清中包含絮狀沉淀，它們是什么，怎么處理？

沉淀包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性，不會影響產(chǎn)品性質(zhì)。要除去沉淀，離心血清（400g，1-2分鐘）或者簡單的讓其沉淀在瓶子底部，將血清小心的轉(zhuǎn)移到另一個無菌瓶里（一般不建議采用過濾的方法除去沉淀，因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾）。大多情況輕輕搖動沉淀并加熱至37℃就會再溶解。所以，使用產(chǎn)品時要搖動并加熱血清至37℃，沉淀會自然消失。

3、實驗室如何選擇適合的血清？

國內(nèi)一致認(rèn)為HYCLONE的血清是最好的，但是根據(jù)我在北美的經(jīng)歷，國外一般認(rèn)為GIBCO比HYCLONE好，所以并不是價格決定質(zhì)量，但是總的來說這兩種價格普遍偏貴，一般不是太嬌氣的細(xì)胞，國產(chǎn)的就夠用了 。此外，由于國內(nèi)HYCLONE，GIBCO并沒有生產(chǎn)線，我們只能從代理商那里買，而代理商又魚龍混雜，所以買到假貨的可能性也很大。所以，我一般會從直銷員那里買血清，有的國外生物公司由于剛剛進入中國，知名度不高，但是其實在 國外已經(jīng)做得很不錯了，如Wisent等，他們在國內(nèi)有辦事處，我會從那里拿，血清的品質(zhì)和HYCLONE不相上下，但價格相對優(yōu)惠很多。

4、 如何避免血清中產(chǎn)生沉淀？

按如下操作可避免沉淀的產(chǎn)生：

（1）解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

（2） 血清分裝凍存時，須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一。

（3） 勿直接由-20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

（4） 勿將血清置于37℃太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成份也會因此受到破壞，從而影響血清的品質(zhì)。

（5） 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

（6） 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

5、 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

6、 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

7、 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量!

8、細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點是污染嗎？如何處理？

一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點生成，首先，要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長的狀態(tài)，黑點是否游動。如果細(xì)胞被污染，微生物則會大量繁殖，培養(yǎng)基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長狀態(tài)良好，與黑點出現(xiàn)前相比，沒有任何變化，那么，黑點的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：

（1）細(xì)胞生長過老，破碎的細(xì)胞殘骸；

（2）血清質(zhì)量不好，反復(fù)凍融的結(jié)果；

（3）配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長；

（4）配制培養(yǎng)基的水質(zhì)、容器不合格?？蓱?yīng)用離心、過濾的方法去除這些黑點；

（5）培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。

9、 細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止黑點生成？

（1） 盡可能地減少血清凍融次數(shù)。

（2） 培養(yǎng)基無需37℃水浴。

（3） 培養(yǎng)基保持最佳PH值7.0- 7.2。

（4） 嚴(yán)格控制配制培養(yǎng)基的水質(zhì)，容器定期刷洗。

（5） 掌握細(xì)胞傳代的最佳時機，細(xì)胞切勿生長過老。

1、 化凍

將血清從-20度冰箱中取出，室溫（或浸于自來水中）化凍（約需要30分鐘至2小時，也可放于4度冰箱化凍過夜；化凍后若不馬上滅活，可以放入4度冰箱中暫時保存）

2、滅活

（1）放入室溫的水浴鍋內(nèi)開始加熱（同時放入一個空的血清瓶，內(nèi)裝100ml自來水，插入一根溫度計，溫度監(jiān)控以此為準(zhǔn)）

（2）當(dāng)溫度計顯示56度時，停止加熱，改為間斷加熱，維持56度（±0.5度）30分鐘（±3分鐘；若不小心使溫度上升超過56度，則：若仍未超過60度，且時間很短，比如不超過5分鐘，則仍可使用；若超過60度，或者時間較長，則棄去不用，或者嘗試用于一些普通細(xì)胞的培養(yǎng)）

（3）取出，自然冷卻至室溫（約需1-3小時），可分裝或-20度繼續(xù)凍存。

3、分裝

（1）轉(zhuǎn)入無菌間，在超凈臺內(nèi)將血清分裝入10ml離心管中（注意預(yù)先要將血清輕輕搖動數(shù)周、混勻；用吸液管或吹大管吹出血清時要注意：不要吹出氣泡（血清很粘稠，很容易產(chǎn)生氣泡；如果產(chǎn)生氣泡，則在酒精燈火焰上過一下））

（2）放入-20度冰箱凍存

（3）全部操作約需要4-6小時

查了點資料，我認(rèn)為胎牛血清是不用滅滅活的。

滅活針對的是補體，補體系統(tǒng)的各成分，以無活性的前體存在于血漿中。需要時，再在激活物如抗原—抗體復(fù)合物等的作用下，依次被激活。

那么胎牛在離開母體前是接觸不到可以做激活物的抗原的，血清里的補體是無活性的，所以就不用滅活的了。推之，小牛血清需要滅活。

不同看法，argue一下：

補體可以通過替代途徑參與免疫反應(yīng)，無免疫球蛋白不代表補體沒有作用。 是否需要滅活主要決定于細(xì)胞培養(yǎng)體系能否激活補體。如果要加入一些損傷明顯的因子，破壞細(xì)胞膜，暴露了糖脂，可以激活補體的。這種情況下的血清要求滅活。

小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別與注意事項

來源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時候,通過心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。 組份與比例不同：兩者所含的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同，用途與用法不同：某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長，而有些細(xì)胞只需小牛血清即可，使用濃度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意：血清應(yīng)保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超過一個月。解凍血清時 ，應(yīng)先將血清至于2-8℃冰箱，并經(jīng)常搖勻使之溶解，然后至室溫放置使之升溫，絕對不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中，如放在37℃解凍，顏色加深，粘稠度也會增加，血清在解凍和熱滅活后，應(yīng)按用量分裝并于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。????

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