固相萃取技術(shù)及其在生物樣本分析中的應(yīng)用與進(jìn)展

固相萃取技術(shù)是一種發(fā)展較快的樣本處理技術(shù)。本文綜述該技術(shù)的基本原理和方法，近年來填料的改進(jìn)，操作方法的創(chuàng)新，自動化儀器的發(fā)展及其在生物樣本分析中的應(yīng)用?！　〗?0年來，儀器分析得到了迅猛發(fā)展，尤其是計算機和微處理技術(shù)的進(jìn)步，使分析方法自動化成為可能。就生物樣本的分析而言，分析過程包括采樣、樣本貯存、樣本制備、待測物的分離和鑒別以及后的定量分析。在這一系列過程中，樣本制備始終是為復(fù)雜、繁瑣卻又為關(guān)鍵的一步。因為在此期間，需要對樣本進(jìn)行分離、凈化和濃集。目前，常用的樣本制備方法仍是液-液萃取(LLE)的方法。但是，它耗時較長，需要樣本的量較大，處理時采用大量有機溶劑，易形成乳化，造成樣本的損失。與此同時，由于高效液相色譜，特別是反相高效液相色譜的成功應(yīng)用，使人們利用色譜理論，采用裝有不同填料的小柱進(jìn)行樣本制備的固相萃取(亦稱液-固萃取)技術(shù)(SPE)日益受到重視。該技術(shù)于70年代初引入分析中，它大大縮短了樣本制備時間，所需樣本量少，避免了乳化現(xiàn)象，而且便于自動化操作，真正實現(xiàn)了生物樣本分析的高效率?！　? SPE方法　　SPE的基本模式 SPE的基本原理是樣品在兩相之間的分配，即在固相(吸附劑)和液相(溶劑)之間的分配。其保留或洗脫的機制取決于被分析物與吸附劑表面的活性基團，以及被分析物與液相之間的分子間作用力。有兩種洗脫模式，一種是被分析物比所存在的生物介質(zhì)與固相之間的親和力更強，因而被保留，然后用一種對被分析物親和力更強的溶劑洗脫;另一種是存在的生物介質(zhì)較被分析物與固相之間親和力更強，則被分析物被直接洗脫。通常使用的為前一種模式?！　PE方法 早的SPE方法是，將含有被分析物的液相倒入盛有適當(dāng)吸附劑的器皿中，振搖一定時間，使被分析物在兩相間分配達(dá)平衡，通過過濾或傾瀉的方法實現(xiàn)兩相的分離。如果吸附劑有效，則大部分被分析物被吸附于固相，然后再用適當(dāng)?shù)娜軇┦怪馕郊纯?。　　現(xiàn)代SPE方法采用長約2~3cm的聚丙烯小柱，內(nèi)裝各種填料，兩端裝有燒結(jié)片或多孔圓片，可通過加壓或抽負(fù)壓的方法使液相經(jīng)過小柱，實驗步驟如下:　　第一步:使用甲醇潤濕小柱，活化填料，以便固相表面易于和被分析物發(fā)生分子間相互作用，同時，可以除去填料中可能存在的雜質(zhì)。李增標(biāo)等比較了柱的濕潤性對多種藥物吸附的影響后指出，C18柱在甲醇含量大于8%的水溶液中才能保持濕潤而有利于藥物的吸附，否則，將導(dǎo)致回收率的降低?！　〉诙?用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過多的甲醇，以便樣本與固相表面發(fā)生作用。但清洗不宜過分，否則會使甲醇含量過低，從而導(dǎo)致濕潤度不足，回收率降低。　　第三步:加樣，使樣本經(jīng)過小柱，棄去廢液?！　〉谒牟?用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，轉(zhuǎn)移樣本中的內(nèi)源性雜質(zhì)和其他相關(guān)雜質(zhì)。　　第五步:選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摫环治鑫?，收集洗脫液，揮干溶劑以備后用或直接進(jìn)行在線分析?！　∫陨系牟僮鞑襟E為分析工作者廣泛采用，同時人們正在努力嘗試新的技術(shù)。為了提高洗脫，縮短溶劑蒸發(fā)時間，Liu等將超臨界流體萃取技術(shù)(SFE)與SPE技術(shù)聯(lián)用，選擇ODS柱，操作至第四步后，將填料移至萃取管置于SFE系統(tǒng)的限制器中，然后以CO2-5%甲醇作為超臨界流體洗脫分析物，分別采用GC-MS和HPLC分析了狗血漿中痕量的美貝維林醇和黃酮，與SPE方法比較，其回收率略低，但也達(dá)到90%左右。　　近年來，SPE技術(shù)更加趨于微量化，出現(xiàn)了用于SPE的膜片以及固相微萃取技術(shù)(SPME)。SPE膜片技術(shù)是將吸附劑固定在一卷微纖維上，置于SPE膜內(nèi)，其厚度僅為0.5mm，可允許更高流速通過，對于大量的低濃度樣本非常實用，可以實現(xiàn)有效的濃集并房與HPLc系統(tǒng)相聯(lián)，Kwakman以此對水中有機磷殺蟲劑進(jìn)行了在線檢測。SPME技術(shù)中的固相為一纖維，可以是熔融石英或覆蓋聚二甲基硅氧烷的熔融石英，聚酚，液晶聚丙烯酸酯，聚乙二醇或石墨。該纖維被置于一個微量注射器的針腔內(nèi)，使用時將針筒推入，則纖維降低，放大樣品液中一段時間，在轉(zhuǎn)子攪拌下，藥物被吸附，然后將纖維退回進(jìn)樣針內(nèi)，當(dāng)迸樣針插入GC進(jìn)樣口時，樣品發(fā)生熱解吸附，從而進(jìn)入分析柱中。Page等采用SPME-頂空GC分析了食物中的揮發(fā)性物質(zhì)?！　? SPE填料　　可應(yīng)用于SPE的填料種類繁多，其中，吸附型的有:活性炭，硅膠，硅藻土，硅酸鎂，氧化鋁等。就化學(xué)鍵合相硅膠而言，正相的有：氨基，腈基，二醇基等；反相的有：C1，C2，C6，C8，C18，腈基，環(huán)己基，等；離子交換的有：季胺，氨基，二氨基，苯磺酸基，羧基等。此外還有聚合物，如苯乙烯-二乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相對于鍵合相填料，聚合物可適用于全部pH范圍，因而用途更廣。通常，人們可以根據(jù)需要選擇填料自行裝柱，而眾多的商品化小柱為分析的便利及精密提供了可靠的保證。目前，世界上多個公司都生產(chǎn)SPE柱，如AnalytichemInt公司的Bond Elut、Waters公司的Sep-Pak系列小柱已廣泛地用于各種分析工作中;國內(nèi)也有廠家生產(chǎn)SPE小柱，如河北津楊濾材廠的PT系列?！　〗陙?，HPLC發(fā)展的另一熱點在于多種新型填料的問世，受其影響，SPE小柱也出現(xiàn)了一些更具選擇性的填料。.硼酸(phenylboronicacid，PBA)鍵合硅膠被用于選擇性地萃取血漿中的一系列β-拮抗劑，其作用機理在于藥物與填料以共價鍵結(jié)合，較為專屬地保留該類含醇羥基的藥物。雙硫腙或二硫代氨基甲酸鹽鍵合硅膠，其作用機理為離子交換，可選擇性地保留重金屬。內(nèi)表面反相吸附劑(internal surface reversed-phase，ISRP)先用于HPLC，該種填料孔隙的內(nèi)表面經(jīng)化學(xué)修飾，而外表面不經(jīng)修飾，處理血樣時無需轉(zhuǎn)移或沉淀蛋白。因為蛋白質(zhì)等大分子不能滲入孔隙內(nèi)部，很快被洗脫，而小分子藥物則進(jìn)入孔隙內(nèi)部被保留。將填料表面經(jīng)化學(xué)修飾后，結(jié)合金屬離子，形成金屬離子覆蓋相。該種固相通過藥物與金屬離子之間形成復(fù)合物，從而保留藥物。Van der Vlies等利用Fe3+覆蓋的8-羥基喹啉鍵合硅膠，專屬地將阿霉素從血漿中萃取出來。環(huán)糊精鍵合的硅膠與藥物結(jié)合，可形成分子排阻型復(fù)合物滯留藥物。Agarwd等成功地用β-環(huán)糊精鍵合硅膠萃取了一系列磺胺類藥物。此外，免疫親和色譜(Immunoaffininty Chromatography，IAC)的發(fā)展，也使人們采用免疫親和固相，從事生物樣本的純化，即制備一種專屬性的抗體，將其固定在瓊脂糖或硅膠上，當(dāng)樣品通過時發(fā)生抗原-抗體結(jié)合，從而專屬性地萃取藥物，該方法在生物活性大分子的分離分析中尤為重要。　　3 SPE的自動化　　在生物樣本分析中往往要處理大量的樣本，雖然SPE的引入使得單個操作較為省時，但大量的重復(fù)操作仍是相當(dāng)耗時的。因此，一段時間內(nèi)，人們都在設(shè)法實現(xiàn)自動化，以使人們從冗長的重復(fù)勞動中解脫出來。目前的自動化儀器可分為半自動和全自動兩種，半自動SPE是指萃取過程機械化，但將洗脫液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣閥則需手工操作;而全自動SPE則是真正的在線操作，整個的萃取和分析過程都由機器控制完成?！　≡绲淖詣踊瘍x器為Du Pont公司的"Prep"系統(tǒng)和Analytichem Int公司的"AASP"。前者屬半自動SPE，萃取的操作是在一個轉(zhuǎn)子上依靠離心力完成的;后者屬全自動SPE，它采用十通閥，利用切換技術(shù)完成全部過程?！　∪缃竦陌胱詣覵PE，一般都是將樣品，小柱，萃取液，廢液管及流分收集管置于特定的架子上，使用機械手及注射泵操作。先從各個專門的瓶子或試管中吸取液體，注入相應(yīng)的小柱中，注射泵加正壓，使液體通過小柱。后，用注射器吸取洗脫液，送入進(jìn)樣口?！　∪詣拥腟PE仍是通過柱切換技術(shù)實現(xiàn)的。采用普通的六通閥與HPLC聯(lián)用，填料一般裝于不銹鋼小柱中，以適應(yīng)系統(tǒng)的高壓。該小柱處于色譜進(jìn)樣閥中定量管的位置，當(dāng)進(jìn)樣閥在Load位置，樣品被泵入小柱，分析物被保留。同時.流動相由另一泵泵入分析柱。當(dāng)預(yù)濃集過程完成后，進(jìn)樣閥置于Inject位置，流動相通過小柱，將分析物轉(zhuǎn)移至分析柱中。這種系統(tǒng)也可被認(rèn)為是"預(yù)柱"或"雙柱"系統(tǒng)，它的缺點是在高壓接頭狀態(tài)引入小柱，使得不同樣品分析時更換小柱較為困難，因而一次分析完成后需沖洗小柱?，F(xiàn)在，可更換柱的商品化儀器也有出現(xiàn)，如荷蘭Spark公司的"Prospect"及Merck公司的"OSP-2"系統(tǒng)?！　? SPE在生物樣本分析中的應(yīng)用　　SPE技術(shù)與LLE技術(shù)相比，在生物樣本分析方面確有較多優(yōu)勢，因而近年來應(yīng)用不斷增多。在80年代初期，每年該方面的論文極少，而90年代以來，每年都有百篇左右的論文發(fā)表?！　kazaki等研究奧弗拉辛及其二甲基和N-氧基代謝物時，比較了SPE和LLE的提取回收率，用LLE法提取時，上述三種物質(zhì)的回收率分別為39.5%，54.7%和小于5%，而用C8 SPE柱，則所有分析物回收率均達(dá)98%。Wientjes等采用LLE提取血漿中2’，3’-二去氧次黃嘌呤核苷(2’，3’-dideoxyinosine)時回收率僅33%，而采用C18 SPE柱則獲得了90%以上的回收率?！　PE技術(shù)萃取的高效性常為分析方法的靈敏度提供可靠的保證。Wells等為了研究布美他尼的藥動學(xué)，從新生兒體內(nèi)取得0.2m1血漿及尿樣進(jìn)行分析。在此之前，由于LLE方法需獲得較大量的樣本，這在臨床上對新生兒及嬰兒的研究是不可能的，而采用SPE，利用其可以處理微量樣本的特點，則獲得了成功。Moriyama等應(yīng)用C18柱萃取，僅用20ml血漿，同時測定了抗癲癇藥撲米酮及其活性代謝產(chǎn)物苯乙基丙二酚和苯巴比妥。Lu等以SPE-柱后光反應(yīng)的HPLC熒光檢測法測定了血漿中痕量的甲氨喋呤和7-羥基甲氨喋呤，其中甲氨喋呤的低檢出限為0.05ng/ml。Stafford等采用二羥基及C18 BondElut小柱處理血漿中抗癌藥GI147211的內(nèi)酯及羧基型成分，低檢出量分別為0.05 ng/ml和0.l ng/ml。Lacroix等建立了SPE-HPLC熒光檢測法測定了人血漿中的神經(jīng)肌阻滯劑米伐庫銨(mivacurium chloride)對映異構(gòu)體及其代謝物，其檢測靈敏度可達(dá)3.9ng/ml。　　Svensson等利用SPE技術(shù)的快速、高效性，作為硫利達(dá)嗪臨床分析的方法，認(rèn)為該技術(shù)用作常規(guī)分析大量生物樣本十分便利。See等采用Sep-Pak小柱將LTD4拮抗劑MK0476從介質(zhì)中萃取，以離子色譜法分析了原料藥中殘留的醋酸鹽。Chen等應(yīng)用ASPEC系統(tǒng)進(jìn)行了體液中藥物的篩選。Muro等以C18小柱萃取尿中的丙戊酸肉堿，隨后以GC-MS方法進(jìn)行測定，從而評價抗驚厥藥物丙戊酸的治療水平。Casas等對體液中一系列的1，4-苯駢二氮雜章類藥物進(jìn)行了研究。Kupferchmidt等研究愛滋病患者血樣中3’-迭氮基-3’-去氧胸腺嘧啶脫氧核苷(3’-azido-3’-deoxythymidine)時指出，SPE方法使樣本處理大程度地被精減為實驗操作的安全提供了保障。　　SPE由于多采用商品化小柱，價格較為昂貴，但是，由于小柱具有重復(fù)使用性，因而，該方法仍有較強的實用價值。Milne等重復(fù)使用C18 SPE柱，處理了14次及其代謝物的血漿樣本，精密度仍很滿意。Van de Water等使用羧基二咪唑(carbonyldi-imidazole)填料的小柱，重復(fù)30次以上，并未發(fā)現(xiàn)明顯的柱效下降?！　PE技術(shù)的出現(xiàn)使生物樣本處理過程大為簡化，自動化SPE的使用真正實現(xiàn)了生物樣本的在線分析。但是，專屬性填料的開發(fā)尚處于起步階段，而自動化儀器仍有待于進(jìn)一步完善，尤其是全自動系統(tǒng)中，如何使小柱更為耐壓且易于更換，值得進(jìn)一步研究。盡管如此，仍然有理由相信SPE技術(shù)會逐步成熟，在樣本處理技術(shù)中處于主要地位。